细胞疗法和再生医学产品拥有非常独特的产业链，在整个产业链上，细胞必须保持活力和功能。超低温保存已成为再生医学产品物流过程和供应链的重要组成部分。在培养液中运输的活细胞只有很短的保质期。保存方法不佳容易限制了使用间充质干细胞（MSC）治疗疾病的能力。比如Prochymal（MSC注射液）用于治疗移植物抗宿主病，但在III期临床试验中失败，细胞解冻后功能不佳是导致治疗失败的原因之一[1, 2]。
当然，Prochymal（MSC注射液）的失败，不仅仅有解冻后细胞功能下降的原因，还可能存在更多的原因，详情请见本公众号之前的分析文章《具有免疫抑制能力的MSC为何败在治疗GVHD的3期临床试验？》
冻存降低MSC的活率和功能低温组织储存研究的起源可以追溯到19世纪末[3]。MSC被使用之前，需要经过一系列的各种检测，从而保证了MSC注射液的安全性。MSC作为种子细胞或者工作细胞，进行超低温冻存，从而在时间上满足各种检测的需求。
不管MSC是作为种子细胞，还是直接制备成注射液的工作库的细胞，要超低温冻存MSC在-80度冰箱和液氮（液相/气相液氮罐）中，都需要用到含有冷冻保护剂（CPA）的冻存液。这些冷冻保护剂可以保护细胞免受冷冻和解冻这两个过程所带来的损伤。
MSC的应用，有2种常见的使用方式：（1），使用培养新鲜的MSC制备成干细胞注射液；（2），使用冻存的MSC直接制备成干细胞注射液。早些年，美国的干细胞公司多采用第2种使用方式，目前已经意识到这种方式的弊端。而我国更多的是采用第1种使用方式。这两种使用方式各有优缺点。
由于超低温保存，MSC细胞活率会受到一定程度的影响，基本上都出现细胞活率下降[1, 4-8]。有的研究团队采用的冻存方案（包括冷冻保护剂配方和冻存/复苏的操作）会导致MSC低至44%的活率[1]，这个44%的活率还不是最低的，还有更低的36%[5]。经过该冻存方案处理的MSC，出现临床治疗效果欠佳，大部分人没意识到是冻存方案出问题。举一个例子来说明这个问题：有一个手力很弱鸡的人，用一把刀来砍树，结果没砍倒树，然后狠狠地责备这把刀不能砍树，其实就是选择性忽视了自己手力的弱鸡。当然，也有团队在处理MSC冻存降低活率方面做的比较好，经过冻存处理，MSC复苏后的活率可以均达到88%以上[8]。
直接采用液氮冻存的MSC，只是在临床应用前进行解冻复苏，然后直接给与MSC回输治疗，这样的操作会导致MSC出现免疫抑制功能的严重下降[1, 2]。另一团队也证实了MSC经过冻存后出现免疫抑制能力下降，即使细胞活率达到88%以上[8]。比较诡异的是，著名的卡罗琳斯卡大学医院的某干细胞团队，其MSC经过冻存后的活率也只有70%，但是却通过实验数据来证明“冻存”这个程序能提高MSC的免疫抑制能力[4]。经过冻存解冻后立刻回输使用的MSC，更容易被体内的免疫细胞（T细胞）所杀伤，加速了机体免疫系统对输入的MSC的清除[9]。冻存不仅会影响到MSC的活率和免疫抑制功能，而且还会诱导MSC出现一定程度的细胞衰老[7, 8]。
一项系统性综述比较了来自41个独立研究的10个物种的骨髓MSC解冻后的评估报告，发现MSC的形态、免疫表型、分化和增殖潜力在很大程度上不受低温保存的影响，但27%的研究报告存活率显著降低[10]。因此，需要重视MSC的冻存对MSC应用疗效的影响。 故，本文重点针对第2种使用方式做详细的介绍，让大家认识到第2种方式的致命缺陷，从而避免或者做出改良，进一步推动干细胞行业的发展。
解冻4小时内，人骨髓MSC的细胞存活率稍微下降，细胞凋亡率增加（最高可达30%），代谢活性和黏附能力降低；解冻后24h，人骨髓MSC的细胞活力恢复，细胞凋亡率下降，但代谢活性和黏附能力仍低于新鲜细胞[11]。冻存和解冻后的细胞受到各种类型的压力，导致细胞膜和细胞骨架发生变化[12]。有研究指出MSC解冻后黏附能力低，是因为MSC胞内的F肌动蛋白被破坏，而不是MSC细胞表面黏附分子脱落[13]
有意思的是，在经历了冻存和解冻之后，三个不同供体来源的骨髓MSC细胞之间出现明显的生物学功能的差异，而这种变异可能与捐献者的年龄和种族有关[11]。有研究提出，24小时的恢复期可能会使MSC恢复到更好的功能状态[6, 11]。一般来说，MSC经过解冻复苏后进入传代培养阶段，MSC的增殖能力和功能特性得到完美的恢复[14-16]。
另外，在超低温保存中，细胞在低温等极端条件下会大量产生活性氧（ROS）[17]，ROS造成的损害可归因于脂质过氧化[18]、蛋白质氧化[19]和DNA损伤[20, 21]。抗氧化剂与冷冻保护剂联合使用可提高冷冻保存效率，但滥用抗氧化剂可能会产生不良结果[22]。
冷冻保护剂介绍
常用的冷冻保护剂有2类：（1）渗透性冷冻保护剂，比如二甲基亚砜（DMSO）、甘油（GLY）、乙二醇（EG）或丙二醇（PG）等。目前常用的冷冻保护剂是二甲基亚砜（10%），在冷冻过程之前加入细胞培养液中，增加细胞膜的孔隙度，从而使水可以更自由地流过细胞膜，有助于防止胞内水晶体的形成[23-25]。（2）非渗透性冷冻保护剂，比如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、棉籽糖、蔗糖和海藻糖等。
DMSO是最常用的冷冻保护剂。人骨髓MSC、猪脂肪MSC和犬骨髓MSC，在10%DMSO的保护下，能在液氮中长期保存数年而不影响MSC的功能特性[26-28]。所有被测试的冷冻保护剂都能够维持羊水来源的MSC的表面标记表达、基因表达和分化，还发现了用DMSO或甘油冻存MSC比蔗糖或海藻糖有更高的活率[29]。在10%DMSO和10%自体血浆的冻存液中冷冻保存超过20年的骨髓细胞被解冻复苏后，能培养出骨髓MSC，但是复苏培养的细胞贴壁率仅为种子细胞的50%，继续培养则MSC恢复正常功能状态[30]。
比较5%、10%和20%的DMSO冻存猪骨髓MSC的存活率、CFU-F，以及Bak和Bcl2的表达，结果是冻存MSC的存活率和CFU-F形成数与DMSO浓度成反比，经5%DMSO冻存的MSC存活率与对照组（新鲜MSC）相当，但是MSC在5%和10%的DMSO中的冻存效果无显著差异[31, 32]。也有一篇文章提到DMSO的浓度可以降至2%，人脂肪MSC在解冻复苏后的细胞活率可以维持在80%以上[33]。
当然渗透性和非渗透性冷冻保护剂也可以一起组合使用，比如棉籽糖和DMSO组合冷冻哺乳动物卵母细胞，可以获得较高的冷冻存活率、受精率和发育率[34]；低浓度的乙二醇（EG）与DMSO组合提高了大鼠和人胰岛细胞的产量、存活率和很好的保障了葡萄糖刺激的胰岛素释放的功能[35]；还可以DMSO、乙二醇和蔗糖三者混合后冻存猪的囊胚[36]。如果MSC混合添加的DMSO的凝胶胶原支架，即使冻存在-80度的冰箱里，6个月的时间能维持90%以上的活率[37]。由4%DMSO+6%海藻糖+10%FBS组成的冻存液，人脂肪MSC细胞解冻后存活率可达80%以上[38]。同样的冻存液配方（5%DMSO+2%PEG+3%海藻糖+2%BSA），对不同动物来源的MSC产生不同的影响（活率和代谢水平）；相比较于大鼠和牛的MSC，这个冻存液配方更适合小鼠MSC[39]。
常用的冷冻保护剂如DMSO对细胞有温度、时间和浓度依赖性的毒性效应，并在患者中引发不良反应[40, 41]。寻找DMSO的无毒替代品，也是一个临床应用所诉求的发展方向。1%脯氨酸和10%四氢甲基嘧啶羧酸（ectoin）组合冻存人MSC，具有和DMSO一样的冻存效果（90%），只是比商品化的无DMSO冷冻溶液Biofreeze稍微逊色[42]。海藻糖、蔗糖、甘油、甘露醇和肌酸搭配组合冻存T细胞，也能达到80%左右的活率[43, 44]。无DMSO和无血清的冻存液，主要的冷冻保护剂是蔗糖、海藻糖和棉籽糖，辅助电穿孔技术（使得胞内的水得以流出胞外），冻存人脐带MSC，MSC细胞的存活率最高为80%，MSC在解冻后24小时方可贴壁，但是胞内的空泡明显增多[45]。
冷冻保护剂的保护原理
添加了冷冻保护剂的冻存液，一般都是高渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）的。当细胞从生理溶液转移到低温保存溶液时，由于胞外溶液中的渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）较高，细胞会脱水，同时低温保存溶液的小分子（如DMSO）扩散到细胞内时，细胞体积会缓慢减少；如果冷冻保存液中只有非穿透性冷冻保护剂（如葡聚糖和蔗糖），细胞也会脱水并保持脱水状态，只是冷冻保护剂不能进入细胞内[46, 47]。在解冻复苏阶段，水从细胞外的低渗溶液迅速移动到细胞内的高渗透溶液，而小分子冷冻保护剂则向相反的方向缓慢移动，导致细胞体积膨胀，并达到细胞内外的渗透压恢复平衡。所以，在细胞冷冻处理和解冻复苏的过程中，稍有差错，细胞就会因为渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）的过度变化，导致细胞膜破裂而死亡。这就是细胞的渗透压力性损伤。
细胞冷却凝固时，细胞内剩余的水量受冷却阶段水外流速率的影响，影响这一速率的三个变量是：细胞表面积与体积的比率、膜的透水性和冷却速率[48]。也就是说，与较小细胞的脱水相比，较大细胞的脱水本质上是缓慢的。应根据细胞大小考虑冷冻保存期间的调整，以便在玻璃化发生之前有足够数量的水退出。可以通过添加不同的冷冻保护剂来改变细胞膜的透水性。冷却速度也是可以调整的。
冷冻保护剂通过加强氢键来改变水的低温行为变化，包括：冰晶形态的变化，冰冻过程中的冰冻温度和冰量[49, 50]。冷冻保护剂一般是高渗的，将细胞长时间置于冷冻保护剂中，可导致两种独立的损伤机制：渗透压力和生物化学毒性[51]。
渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）变化导致的细胞损伤，如前所述。含DMSO的冷冻保护剂，通常可以观察到DMSO对细胞活力的不良影响，这是由DMSO导致的生物化学毒性损伤。DMSO添加到冷冻保护剂溶液中会出现放热现象，因此，需要提前配置和预冷冷冻保护剂溶液。为了在解冻后去除冷冻保护剂溶液，可以使用渗透压稍高的洗涤液慢慢稀释细胞，然后在必要时洗涤细胞[52]。因此，对于新的低温保存液的开发，评估冷冻保护剂的生化毒性是至关重要的。理想情况下，冷冻保存溶液的成分应该是临床级的。
细胞冻融的程序
基本原则：慢冻速融即使细胞有冷冻保护剂的保护，在冷冻过程中，也需要非常注意温度的下降程序。总的要求是在冷冻过程中，尽可能减少胞内冰晶的出现，即尽可能让胞内流动的水通过渗透压（摩尔浓度渗透压，摩尔渗透压）差的存在而流出胞外。实验室的常规操作是经过4个温度梯度的适应性过渡变化：4度、-20度、-80度、液氮。这种常规操作很难做到标准化和精准化。现在可以通过使用可控速率的设备（程序降温仪）来实现细胞环境能以稳定的1度/分钟（或其他速率）的幅度来降温。
冷冻过程中，需要将细胞从冰箱或其他设备转移到存储液氮罐，在此转移过程中，需要快速操作，避免细胞可能会迅速升温而导致冷冻保护剂熔化，从而导致细胞损伤。由于渗透性冷冻保护剂通过氢键与水发生强烈的相互作用，水的冰点被降低，可与自身相互作用形成晶体所需的关键位点的水分子就会减少。
冻存细胞的复苏，必须给细胞迅速升温，以防止冰的再结晶。解冻后细胞的活率取决于解冻过程中，细胞内和细胞外冰晶的数量和大小，因为胞内外的冰晶能直接刺破细胞膜和胞内亚器官。
常规做法是将样品从储存库/冰柜中取出，浸泡在37摄氏度的水浴中，然后轻轻旋转，直到冰消失，以实现最大的存活率[53]。用水浴解冻细胞有几个明显的局限性。由于技能或习惯的原因，不同的操作员可能不会以完全相同的方式执行解冻程序。减少解冻过程的可变性，需要训练有素的操作员，并建立标准化的解冻程序。在水浴中解冻的细胞也有被污染的风险，因为水浴对环境是开放的。新的干式解冻装置，可以克服水浴锅中解冻细胞的限制，尤其适用于解冻有价值的细胞疗法。
解冻后洗涤是去除冷冻保护剂最常见的方法，即对细胞进行洗涤液或培养液重悬后离心，去除上清液，然后将细胞重新悬浮在洗涤液或培养液中。然而，需要注意的是，解冻后洗涤会造成冻存细胞的数量损失。
MSC注射液的低温运输
MSC注射液的低温运输也是一个不可忽视的小问题，能影响到MSC在应用前的细胞活率。故而目前都建议MSC注射液（在人血清白蛋白的保护下）在24小时内使用[54]。人脂肪MSC在5°C的含海藻糖的保存液中24小时后，MSC的存活率可达95%[55]。人骨髓MSC含海藻糖的保存液中4度冷藏72小时后，MSC的存活率不到80%，但MSC的免疫抑制功能稍有下降[56]。MSC重悬在含40 mM海藻糖的细胞保存液中，4度环境下，MSC在7天的存活率保持在90%以上[57]。
冻存的细胞，尤其是制备成注射液后的细胞，在运输过程中可能会经历各种应力，包括温度波动、机械振动和冲击以及压力变化。减少样品在运输过程中的可变性和保持稳定性，需要全面的运输考虑和制定经过验证的运输流程，即运输流程尽可能地在经历各种情况后不影响细胞的功能。
3D支架的联合使用
将MSC贴附在生物相容性材料制成的支架上进行冷冻保存，形成即用的移植单元，用于修复骨、软骨或皮肤的损伤。常见做法是将MSC冷冻保存在海藻酸盐微球中。海藻酸钠是一种天然多糖，具有吸水性，通过吸收水分可以防止在冻结过程中形成大冰晶，良好的生物相容性和生物降解性。在10%DMSO的存在下，冷冻保存的海藻酸盐包裹的MSC获得了90%的解冻后存活率[58]。将脐带来源的MSC接种于含10%DMSO的海藻酸盐-明胶支架中，再冻存于液氮，但是复苏后细胞死亡较多，而且24小时的增殖速度减慢[59]。
在一项研究中，将一段脐带（2-3厘米）浸泡在含有10%DMSO和0.2M蔗糖的培养基中，并以1/分钟的速度冷却到-80度，然后转移到液氮中保存5~29天，组织解冻复苏后能继续培养出MSC，但是MSC增殖速度慢和细胞数量稀少[60, 61]。甚至也有报告脐带组织经过含10%DMSO、5%甘油和20%FBS的冻存液冷冻保存在液氮后，未能从解冻复苏的脐带中培养出MSC[62]。相类似的，冷冻完整的牙齿中大约只有20%-30%经过解冻复苏后培养出牙髓MSC[16, 63]。
总结
理论上，MSC冻存在-196度的液氮里面（或气相液氮），细胞所有的生命活动都是处于静止状态，那么细胞的生命能永恒保存，只要不出现液氮补充不及时等情况。
虽然冷冻保存程序可能会影响几个细胞过程，包括细胞存活、细胞功能、蛋白质表达、DNA完整性（表观遗传）、细胞骨架和核结构，但是相同的冻存方案对不同类型的细胞有不同程度和不同方面的差异化影响[64, 65]。
除了冻存液配方，合适的冻存细胞浓度也是一个不可忽视的影响因素。几项研究表明，较高的有核细胞浓度（高达2亿个细胞/毫升）对低温保存剂具有良好的耐受性，并可产生良好的临床结果[66, 67]。也有专家建议人MSC的细胞冻存浓度为(2-25)x106/毫升[68]。这个细胞浓度的范围，还是比较宽泛的。
冷冻保存细胞的目的是保持细胞的关键生物学特性，以确保适当的解冻后功能，包括细胞完整性、代谢活性、增殖活性、分化潜力和治疗功效的检测[3, 69]。虽然使用膜完整性染料测量细胞的物理完整性是解冻后评估最广泛的方法，但是用膜完整性作为衡量细胞存活率、功能的指标并不可靠，还应进行其他关键生物学特性的表征，如代谢活性、增殖活性或反映细胞功能的指标[70]。简而言之，活力和功能检测是确定解冻后细胞质量和提高当前冷冻保存方法效率的重要判断指标。
细胞治疗行业的规范化发展，涉及细胞运输、细胞储存、细胞供应的可用性以及质量控制的时间，都需要考虑到冷冻保存方案/程序应该在遵循GMP原则的同时提供大规模功能良好的细胞产品[65]。大容量程序化冷冻设备的发展和应用，能解决细胞的大规模冻存的工业化问题，和促进细胞治疗行业的良好发展[71, 72]。
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